中文名称:EZH2-L基因可变剪切敲除心肌肥厚小鼠模型
英文名称:Mouse model of EZH2-L gene specific splicing knockout cardiac hypertrophy disease
类型:心肌肥厚动物模型
分级:NA
用途:用于心肌肥厚研究。
研制单位:武汉大学
保存单位:武汉大学
1.一种EZH2可变剪切体,剪切位点位于EZH2第三号外显子3’端前27nt的位置,由此得到的两个可变剪切体相差27nt,具有27nt和缺失27nt分别被称为EZH2-L和EZH2-S;所述27nt的序列在小鼠和人中为gtgagctcattgcgcgggactagggag,在大鼠中为gtgagctcattacgcgggactagggag。
2.构建PE诱导的心肌肥大细胞模型,检测EZH2_L过表达以及敲低后心肌肥厚分子标志物水平,分别提取总RNA,通过qRT-PCR检测心肌肥厚指标Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。
3. 建立主动脉缩窄建立小鼠心肌肥厚模型(TAC手术),通过超声心动图评价心脏功能,小鼠采用异氟脘吸入麻醉,将小鼠左胸前区剃毛,涂抹耦合剂,取仰卧位对小鼠行超声检查。采用高频超声诊断仪(VET V6,VINNO,中国),频率为12.5MHz,选取标准左心室乳头肌短轴切面,测量各项指标。
4.小鼠心脏组织切片形态及病理检测 称取小鼠体重,小鼠经心脏灌注,取出心脏后用滤纸吸干血液后称重,计算心脏重量与体重的比值(Heart weight/body weight,HW/BW),并通过qRT-PCR检测EZH2_L和EZH2_S的mRNA水平。
1.鉴定PCR结果图解
2.示意图
图1 是新生大鼠心肌细胞中鉴定出来的EZH2第3号外显子5’端的2种可变剪切形式,保留27bp的为EZH2-L,缺少27bp的为EZH2-S;3. 新生大鼠心肌细胞EZH2-L的检测 对siRNA可结合EZH2-L的靶点序列进行筛选,结果如表1,其中catgacttctgtgagctcattacgc为筛选出的最佳大鼠siRNA结合靶点,对应的siRNA序列如下所示(图2A) 所得结果如图2B所示,在新生大鼠心肌细胞中检测到了EZH2的两种可变剪切形式EZH2-L和EZH2-S,且siEZH2-L和siEZH2-S分别敲低了EZH2-L和EZH2-S的mRNA水平。 通过qPCR方法,检测EZH2-L和EZH2-S的mRNA的表达水平,验证siRNA 特异性分别敲低EZH2-L和EZH2-S的敲低效率。结果如图2C所示,新生大鼠心肌细胞中EZH2-L和EZH2-S可以分别被siEZH2-L和siEZH2-S敲低。
图2是EZH2可变剪切体的检测,以及实时荧光定量PCR(qPCR)验证siEZH2-L和siEZH2-S敲低效率;A为EZH2-L和EZH2-S特异性的siRNA序列;B为新生大鼠心肌细胞中EZH2-L和EZH2-S分别敲低后逆转录PCR(RT-PCR)的琼脂糖凝胶电泳图;C为新生大鼠心肌细胞中EZH2-L和EZH2-S分别被敲低后各自mRNA水平的qPCR结果;
4.EZH2-L敲低后对体外培养新生大鼠心肌细胞肥大的影响
如图3A和B所示,在EZH2-L可变剪切形式敲低后,苯肾上腺素诱导组的心肌细胞肥大标志物ANP、BNP的水平显著减低,说明EZH2-L可变剪切形式可显著减轻心肌细胞肥大水平。如图3C和D所示,在EZH2-S可变剪切形式敲低后,苯肾上腺素诱导组的心肌细胞肥大标志物ANP、BNP的水平显著增加,说明EZH2-S可变剪切形式可显著加重心肌细胞肥大水平。以上结果表明EZH2的不同剪切形式EZH2-L和EZH2-S在心肌肥厚和心力衰竭病理发生中发挥了重要调控作用。
图3是EZH2-L和EZH2-S敲低后对体外培养新生大鼠心肌细胞肥大标志物ANP和BNP的影响;A和B为EZH2-L可变剪切形式敲低后,苯肾上腺素诱导组的心肌细胞肥大标志物ANP、BNP的水平;C和D为在EZH2-S可变剪切形式敲低后,苯肾上腺素诱导组的心肌细胞肥大标志物ANP、BNP的水平;
5.EZH2-L敲低后对体外培养新生大鼠心肌细胞面积的影响
如图4A和B所示,在EZH2-L可变剪切形式敲低后,苯肾上腺素诱导组的心肌细胞面积显著减低。如图4A和C所示,在EZH2-S可变剪切形式敲低后,苯肾上腺素诱导组的心肌细胞面积显著增加。以上结果表明EZH2-L和EZH2-S敲低后可影响苯肾上腺素诱导新生大鼠心肌细胞肥大的细胞面积。图4A为代表性的WGA染色图;图4B和C为细胞面积统计结果。
图4是EZH2-L和EZH2-S敲低后对体外培养新生大鼠心肌细胞面积的影响;A为代表性的WGA染色;B和C为细胞面积统计结果。
6.特异敲低EZH2-L对主动脉狭窄术诱导心肌肥厚和心力衰竭的影响
如图5A代表性的心脏图片和图5B心重体重比(mg/g)的统计结果所示,敲低EZH2-L可以抑制心肌肥厚和心力衰竭的发生,而敲低EZH2-S可以促进心肌肥厚和心力衰竭的发生。图5C为EZH2-L和EZH2-S分别被AAV9-shRNA特异敲低的qPCR验证结果。
图5是特异敲低EZH2-L和EZH2-S对主动脉狭窄术诱导心肌肥厚和心力衰竭的影响;通过尾静脉注射使小鼠感染EZH2-L和EZH2-S特异的AAV9-shRNA(AAV9-shEZH2-L/AAV9-shEZH2-S),三周后进行主动脉狭窄术诱导心肌肥厚和心力衰竭发生,术后8周观察心脏形态并测量心脏重量。A为代表性的心脏图片;B为心重体重比(mg/g)的统计结果;C为EZH2-L和EZH2-S分别被AAV9-shRNA特异敲低的qPCR结果。
模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室,实验动物使用许可证SYXK(鄂)2015-0027。
(1)建筑特点
门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间,小鼠饲养室3间,隔离观察室1间,实验准备室1间,洁物存放室1间,清洗消毒室1间。此外,屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。
(2)设计参数
室内温度:20~26°C;日温差:≤4°C;相对湿度:40%~70%;换气次数:15~20次/h;气流速度:≤0.2m/s;压强梯度:20~50Pa;空气洁净度:7级;菌落数:≤3个/皿;氨浓度:≤14mg/m3;噪声:≤60dB;Z低工作照度:≥200lx;动物照度:15~20lx;昼夜明暗交替时间:12/12h。
(3)通风和空调系统
动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。
(4)照明系统
一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关,根据实际需要,调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。
(5)通讯系统
因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求,人员进入后不能随意出入,而室内外的联系又十分重要,故室内各房间均安装内部电话机,按照房间顺序编排电话号码,各室内电话可相互连通,并均与监控室总机保持联系,保证实验室内外信息的及时沟通。
(6)监控系统
对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机,能够及时了解设施的运行状态;也能有效督促实验人员执行科学的操作规程,避免人为因素造成室内环境和设施的污染;并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察,减少对动物的滋扰。
(7)供水系统
SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水,将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室,设置接水槽,为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道,清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。
(8)供电系统、警报系统和消防设施
SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电,如果出现故障,不能及时发现和处理,就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡,造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统,并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统,以便及时检修和维护,保证设施的安全运行。
(9)消毒灭菌设备
为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染,按照不同物品的特性,进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。
(10)动物饲养笼具
饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具,具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm,适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物,配有底盘和食槽,确保实验动物有充足的采食和活动空间,同时也保证室内环境的清洁。
(11)垫料的选择和使用
在使用塑胶垫料时,垫料是大小鼠直接接触的铺垫物,起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前,所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。
(12)饲料配制
大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准,进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标,保证饲料的质量。
EZH2基因敲除小鼠模型,采用的是基于CRISPR/Cas9技术的完全性基因敲除(Conventional Knockout, KO)。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外显子或几个总要的外显子功能区敲除掉,获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。条件性基因敲除(Conditional Knockout, CKO),是可以在特定的组织或细胞中敲除该基因,而该基因在其他组织或细胞表达正常。相较于CKO,KO小鼠采集任意组织器官的cDNA,PCR扩增,即可鉴定是否目的基因敲除成功。
CRISPR/Cas9技术的优点在于其对基因进行定位的精准编辑,在向导RNA(guide RNA,gRNA)和Cas9蛋白的共同作用下,细胞基因组DNA(被看成外源DNA)将被准确剪切。但是,被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一,待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(NGG)。第二,向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。
EZH2基因敲除小鼠模型为完全性基因敲除模型(KO), EZH2基因在小鼠的任意组织器官均被敲除。该模型应用范围广,可以制造针对各类疾病不同组织器官细胞的疾病模型。